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Estudo Funcional de Mutantes da Proteína Prion Celular Associados à Doenças por Prion
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15% of the eluate was used on a 7% SDS-PAGE, followed by immunoblotting with anti-FLAG (Sigma-Aldrich). The re- maining part of the eluate was used on a 12% SDS-PAGE, followed by immunoblotting with anti-PrPC (9).
Colocalization with mGluRs
Primary hippocampal neurons were fixed in 4% paraformal- dehyde and permeabilized with PBS plus 0.5% Triton X-100 for 5 min. Nonspecific epitopes were blocked by incubation
C
Transfection of HEK 293 cells with mGluR1 and mGluR5 and reconstitution of PrPC-Ln `)1 peptide signaling
Human embryonic kidney (HEK293) cells were maintained in MEM (Invitrogen) supplemented with 10% FBS, 100 IU penicillin, and 100 f,Lg/ml streptomycin at 37°C in a humid- ified atmosphere containing 5% CO2. Cells were transfected using a modified calcium phosphate method with a plasmid expressing a mouse PrPC (22) plus Flag-mGluR1a or Flag- mGluR5a cDNAs (23, 24). For Ca2+…
Colocalization with mGluRs
Primary hippocampal neurons were fixed in 4% paraformal- dehyde and permeabilized with PBS plus 0.5% Triton X-100 for 5 min. Nonspecific epitopes were blocked by incubation
C
monitored in each experiment. Traces represent a typical
with PBS plus 5% BSA for 1 h. Mouse anti-PrP
C
(9), goat
with PBS plus 5% BSA for 1 h. Mouse anti-PrP
C
(9), goat
single cell response.
anti-PrP
(Abcam, Cambridge, MA, USA), rabbit anti-
anti-PrP
(Abcam, Cambridge, MA, USA), rabbit anti-
Transfection of HEK 293 cells with mGluR1 and mGluR5 and reconstitution of PrPC-Ln `)1 peptide signaling
Human embryonic kidney (HEK293) cells were maintained in MEM (Invitrogen) supplemented with 10% FBS, 100 IU penicillin, and 100 f,Lg/ml streptomycin at 37°C in a humid- ified atmosphere containing 5% CO2. Cells were transfected using a modified calcium phosphate method with a plasmid expressing a mouse PrPC (22) plus Flag-mGluR1a or Flag- mGluR5a cDNAs (23, 24). For Ca2+…
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