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Estudo Funcional de Mutantes da Proteína Prion Celular Associados à Doenças por Prion
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modifications in secreted STI1 as well as the presence of coacti- vators in the CM may contribute for this higher activity com- pared with the recombinant protein.
STI1 binds to cells in a specific manner and is internalized
To evaluate STI1 interaction with the cell membrane and its pos- sible dependency on expression of PrP C at the cell surface, re- combinant STI1 or the deletion mutant unable to bind PrP C, STI1<l230 –245 (Lopes et al., 2005), were labeled using AF488, AF568, or AF594. Control experiments showed that labeling STI1 as well as STI1<l230 –245 did not produce any degradation (supple- mental Fig. 1 A, B, available at www.jneurosci.org as supplemen- tal material) and labeled proteins are able to evoke PKA activity in cultured hippocampal neurons (supplemental Fig. 1C, available at www.jneurosci.org as supplemental material) and are there- fore functional. Interestingly, STI1–AF568 bound to hippocam- pal neurons from both wild-type (Prnp +/+) (Fig. 5A) and PrP C-
lowed by incubation with fluorescent STI.
To test whether fluorescent STI1 is present in the same or- ganelles as PrP C, we did a series of double-labeling experiments in living cells using GFP-tagged markers of internalization path- ways. We chose to study trafficking in living cells to avoid possible fixation artifacts, because GPI-anchored proteins such as PrP C may change location after fixation, and we…
STI1 binds to cells in a specific manner and is internalized
To evaluate STI1 interaction with the cell membrane and its pos- sible dependency on expression of PrP C at the cell surface, re- combinant STI1 or the deletion mutant unable to bind PrP C, STI1<l230 –245 (Lopes et al., 2005), were labeled using AF488, AF568, or AF594. Control experiments showed that labeling STI1 as well as STI1<l230 –245 did not produce any degradation (supple- mental Fig. 1 A, B, available at www.jneurosci.org as supplemen- tal material) and labeled proteins are able to evoke PKA activity in cultured hippocampal neurons (supplemental Fig. 1C, available at www.jneurosci.org as supplemental material) and are there- fore functional. Interestingly, STI1–AF568 bound to hippocam- pal neurons from both wild-type (Prnp +/+) (Fig. 5A) and PrP C-
lowed by incubation with fluorescent STI.
To test whether fluorescent STI1 is present in the same or- ganelles as PrP C, we did a series of double-labeling experiments in living cells using GFP-tagged markers of internalization path- ways. We chose to study trafficking in living cells to avoid possible fixation artifacts, because GPI-anchored proteins such as PrP C may change location after fixation, and we…
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