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Estudo Funcional de Mutantes da Proteína Prion Celular Associados à Doenças por Prion
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Numa primeira abordagem, foram avaliadas as concentrações basais de Ca2+ citossólico e de retículo endoplasmático (ER) entre as células CF10, CF10 PrP3F4 e aquelas expressando os diferentes mutantes de PrPC. Três ensaios independentes foram realizados e não observamos diferenças estatísticas entre as concentrações basais de Ca2+ citosólico livre e nos estoques no ER entre as linhagens (Figura 32).
Legenda: As concentrações basais de cálcio em CF10 e em CF10 expressando as diferentes construções de PrPC são semelhantes. A- Concentrações basais de Ca2+ citossólico. As células foram incubadas com 10μM Fluo-3AM e, após o período de
incubação, uma primeira leitura de fluorescência foi analilzada em um espectrofluorímetro. A seguir, foi adicionado 100μM digitonina (um detergente que lisa as células fazendo com que o Fluo-3 livre interaja com o Ca2+ do meio extracelular, obtendo-se assim uma leitura de
fluorescência máxima que reflete a concentração total de Ca2+ no sistema) e, em seguida,
16mM EGTA para uma terceira leitura (um quelante de íons que compete com Fluo-3 pela ligação com Ca2+ e que resultará na obtenção de uma fluorescênica mínima). O cálculo de concetração foi feito através da fórmula [Ca2+]ci free nM= kd Fluo-3AM a 22ºC pH7,2 (F…
Legenda: As concentrações basais de cálcio em CF10 e em CF10 expressando as diferentes construções de PrPC são semelhantes. A- Concentrações basais de Ca2+ citossólico. As células foram incubadas com 10μM Fluo-3AM e, após o período de
incubação, uma primeira leitura de fluorescência foi analilzada em um espectrofluorímetro. A seguir, foi adicionado 100μM digitonina (um detergente que lisa as células fazendo com que o Fluo-3 livre interaja com o Ca2+ do meio extracelular, obtendo-se assim uma leitura de
fluorescência máxima que reflete a concentração total de Ca2+ no sistema) e, em seguida,
16mM EGTA para uma terceira leitura (um quelante de íons que compete com Fluo-3 pela ligação com Ca2+ e que resultará na obtenção de uma fluorescênica mínima). O cálculo de concetração foi feito através da fórmula [Ca2+]ci free nM= kd Fluo-3AM a 22ºC pH7,2 (F…
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