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Estudo Funcional de Mutantes da Proteína Prion Celular Associados à Doenças por Prion
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200 mM β-mercaptoetanol, 40% de bromofenol blue). Os extratos protéicos foram sonicados, aquecidos à 100oC, e em seguida, as proteínas foram separadas através de eletroforese e submetidas à western blotting. Os anticorpos utilizados foram: anticorpo policlonal anti-mapk (PhosphoPlus p44/42 MAP Kinase Thr202/Tyr204 - Cell Signaling) que reconhece as formas fosforiladas de MAPK p44 e 42 (ERK 1 e ERK 2), produzido em coelho e usado na diluição 1:1000, e anti-IgG de coelho conjugado à peroxidase diluído 1:2000 em TBST. Após a imunodetecção de p42/44MAPK
fosforilada, realizou-se uma lavagem com 1M NaOH por 5 minutos para remover o anticorpo primário contra p42/44MAPK fosforilada da membrana. Após esse procedimento, realizou-se o ensaio de western blotting utilizando o anticorpo policlonal anti-p42/44MAPK (p44/42 MAP Kinase Thr202/Tyr204
- Cell Signaling) que reconhece as formas totais de MAPK p44 e 42 (ERK 1 e ERK 2 - Cell Signaling). Os valores foram relativizados segundo a atividade basal na célula CF10 sem tratamento.
As células CF10 (105 células) foram cultivadas em meio sem soro fetal bovino em placas de 35mm. Após 48 horas de incubação, as células foram tratadas com o inibidor de fosfodiesterase IBMX (50mM) por 1 h a 37°C. O ativador…
fosforilada, realizou-se uma lavagem com 1M NaOH por 5 minutos para remover o anticorpo primário contra p42/44MAPK fosforilada da membrana. Após esse procedimento, realizou-se o ensaio de western blotting utilizando o anticorpo policlonal anti-p42/44MAPK (p44/42 MAP Kinase Thr202/Tyr204
- Cell Signaling) que reconhece as formas totais de MAPK p44 e 42 (ERK 1 e ERK 2 - Cell Signaling). Os valores foram relativizados segundo a atividade basal na célula CF10 sem tratamento.
3.14 ATIVIDADE DE PKA
As células CF10 (105 células) foram cultivadas em meio sem soro fetal bovino em placas de 35mm. Após 48 horas de incubação, as células foram tratadas com o inibidor de fosfodiesterase IBMX (50mM) por 1 h a 37°C. O ativador…
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