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Estudo Funcional de Mutantes da Proteína Prion Celular Associados à Doenças por Prion
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3.8 CITOSSENSOR
Para medidas de variação do pH extracelular foram plaqueadas 1x105 células CF10 (knockout de PrPC) e CF10 transfectadas com PrPC tipo selvagem (CF10 PrP3F4) em Transwell Permeable Supports (Corning) em
meio OptiMEM (Invitrogen) contendo Glutamina (2mM) (Invitrogen), penicilina (100IU) e estreptomicina (100μg/ml) (Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal bovino. Após as células aderirem no transwell, trocamos o meio para OptiMEM sem soro por 48h. As células foram mantidas em meio sem bicarbonato numa solução de DMEM com 0,09M NaCl e 4mM Glutamina, pH 7,35 para a leitura no Cytosensor® Microphysiometer System.
Os traswells contendo as células foram transferidos para uma câmara de fluxo com temperatura controlada acoplada ao equipamento. Bombas peristálticas transportam meio de cultura através da câmera. Com um fluxo constante, as células recebem nutrientes e produtos de degradação metabólica são removidos. Quando o fluxo foi interrompido, normalmente por 1 min., prótons excretados acumulam e acidificam o meio extracelular. Essa
acidificação gira em torno de 0,05 a 0,1 unidades de pH e podem ser detectadas pelo sensor do…
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