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DNA: Evolu? dos processos de Seq^iamento e An?se
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Para realizar esta técnica é necessário marcar o DNA alvo, ou seja, aquele a ser seqüenciado para que funcione como prova após a degradação química especifica, conseguida marcando-se o DNA, tanto de fita simples como o de fita dupla, com um composto radioativo chamado de fósforo 32 (32P). O composto é adicionado a uma das extremidades do DNA a ser seqüenciado, pode ser tanto no final 3´ quanto no final 5´.
O principio básico deste método é a decomposição química da molécula de DNA marcada em pontos específicos. O tratamento químico causa clivagem especifica em G, C, G+A, e T+C. Cada reação ocorre em um tubo diferente de modo que os fragmentos resultantes sejam analisados por migração eletroforética em gel de poli acrimida.
Exemplo de ssDNA marcado:
3´(32P) XX GGCACGACAGGTTTCCCGACCGCAACGTTAAG..............ATT 5´
O seqüenciamento químico: primeiramente, marca-se a extremidade terminal (que fica a critério do analista, se é na extremidade 3´ ou na 5´ )do DNA de fita dupla a ser seqüenciado com o grupo radioativo (32P). Este processo é catalisado pela enzima Polynucleotide kinase sendo que 32P-dATP são usados.
Na fase seguinte, com a utilização de dimetil sulfato e aquecimento a 90 graus Celsius, rompe-se as pontes de Hidrogenio, separando as duas fitas do DNA, que podem ser puificadas através da eletroforese. As fitas são separadas devido a diferença de peso molecular. Há pontos onde ocorre…
O principio básico deste método é a decomposição química da molécula de DNA marcada em pontos específicos. O tratamento químico causa clivagem especifica em G, C, G+A, e T+C. Cada reação ocorre em um tubo diferente de modo que os fragmentos resultantes sejam analisados por migração eletroforética em gel de poli acrimida.
Exemplo de ssDNA marcado:
3´(32P) XX GGCACGACAGGTTTCCCGACCGCAACGTTAAG..............ATT 5´
O seqüenciamento químico: primeiramente, marca-se a extremidade terminal (que fica a critério do analista, se é na extremidade 3´ ou na 5´ )do DNA de fita dupla a ser seqüenciado com o grupo radioativo (32P). Este processo é catalisado pela enzima Polynucleotide kinase sendo que 32P-dATP são usados.
Na fase seguinte, com a utilização de dimetil sulfato e aquecimento a 90 graus Celsius, rompe-se as pontes de Hidrogenio, separando as duas fitas do DNA, que podem ser puificadas através da eletroforese. As fitas são separadas devido a diferença de peso molecular. Há pontos onde ocorre…
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