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Atividade Funcional da Proteína Prion Celular com o Polimorfismo N171S e a Mutação D178N Presentes no Domínio de Ligação à Lâmina
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murina recombinante e que reconhece PrPC murino e humano) em PBS/BSA
0,5% Azida Sódica 0,05% por 1h à 4ºC. A seguir, as células foram lavadas e incubadas com anticorpo secundário (anti-camundongo marcado com phycoeritrina, PE) em mesmo tampão, por 1h à 4ºC. A leitura da fluorescência foi realizada em aparelho BD FACScan ou BD FACSCalibur
(Becton Dickinson), nos programas Cell Lyses ou Cell Quest Pro, respectivamente. Para a análise de fluorescência de GFP e de PE utilizamos laser de argônio (emissão 488nm) e detectores de 530nm (GFP) e 585nm (PE).
As populações de N2a expressando as diversas construções foram submetidas à clonagem celular por diluição limitante. Esses clones foram novamente avaliados por citometria de fluxo para depois serem submetidos a ensaios de migração.
A constatação da expressão de PrPC em células N2a foi feita, a
princípio, pela presença de fluorescência de GFP através de citometria de fluxo. Utilizamos a média geométrica da intensidade de fluorescência para avaliar a quantidade de GFP expresso em cada clone, tendo as células não transfectadas como padrão de comparação. Esse valor médio é obtido através do histograma de análise do ensaio de citometria e é calculado através da raiz quadrada do produto da emissão de cada um dos…
0,5% Azida Sódica 0,05% por 1h à 4ºC. A seguir, as células foram lavadas e incubadas com anticorpo secundário (anti-camundongo marcado com phycoeritrina, PE) em mesmo tampão, por 1h à 4ºC. A leitura da fluorescência foi realizada em aparelho BD FACScan ou BD FACSCalibur
(Becton Dickinson), nos programas Cell Lyses ou Cell Quest Pro, respectivamente. Para a análise de fluorescência de GFP e de PE utilizamos laser de argônio (emissão 488nm) e detectores de 530nm (GFP) e 585nm (PE).
As populações de N2a expressando as diversas construções foram submetidas à clonagem celular por diluição limitante. Esses clones foram novamente avaliados por citometria de fluxo para depois serem submetidos a ensaios de migração.
A constatação da expressão de PrPC em células N2a foi feita, a
princípio, pela presença de fluorescência de GFP através de citometria de fluxo. Utilizamos a média geométrica da intensidade de fluorescência para avaliar a quantidade de GFP expresso em cada clone, tendo as células não transfectadas como padrão de comparação. Esse valor médio é obtido através do histograma de análise do ensaio de citometria e é calculado através da raiz quadrada do produto da emissão de cada um dos…
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