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Métodos de Coloração - Método Simples e Método de Gram

Trabalho por Danila Mayara Lemos de Souza, estudante de Biologia @ , Em 01/04/2006

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Coloração Simples e Coloração de Gram


Introdução

Grande parte dos microrganismos presente em nosso cotidiano, e os estudados em laboratórios são microrganismos e quase sempre invisíveis. Por isso há necessidade do uso do microscópio eletrônico e principalmente dos métodos de coloração específicos.

Coloração significa corar os microrganismos com um corante que enfatiza certas estruturas. Essas técnicas de coloração servem para mostrar as varias estruturas dos microrganismos, identificar suas estruturas internas e externas (como flagelos, membranas, cápsulas, entre outros) e ajudar a identificar e separar microrganismos similares. As colorações podem ser feitas com um ou mais corantes. Para colorar um microrganismo é necessário que esteja fixado à lâmina para visualização no microscópio.

Entre os vários métodos de coloração pode-se destacar dois: coloração simples e coloração de Gram.

O método de COLORAÇÃO SIMPLES consiste em uma solução aquosa ou alcoólica de um único corante básico. O objetivo básico desse método é mostrar toda a estrutura do microrganismo incluindo a forma e as estruturas básicas.

A coloração simples é aplicada no esfregaço (fixado por um certo tempo) e então lavada. A lâmina é examinada quando seca. Pode-se adicionar uma substancia química para intensificar a coloração, essa substância é denominada MORDETE, esse mordete aumenta a coloração da amostra microbiológica, reveste estruturas tornando-se mais espessas e mais fácil a sua visualização.

Outro método é a COLORAÇÃO DE GRAM. Esse método foi desenvolvido por Hans Christian Gram. A coloração por ele desenvolvida foi baseada na parede celular para identificação das espécies em dois grupos: Gram positiva e Gram negativa.

Existem outros métodos de coloração além desses citados, como: coloração de resistência ao álcool-acido, coloração para endósporos (esporos), coloração dos flagelos entre outros.


Objetivos

  • Evidenciar microrganismos, verificando diferenças morfológicas e de comportamento tintorial, utilizando colorações.
  • Treinar a técnica de colorações.


Materiais

  • Bateria de corantes (cristal violeta e fucsina) e reagentes (álcool e lugol) para a técnica de Gram;
  • Lâminas;
  • Óleo de imersão, papel absorvente;
  • Culturas de microrganismos: klebsiella e Bacillus thuringiensis;
  • Iogurte natural;
  • Corante azul de metileno;
  • Alça de níquel e bico de Bunsen;
  • Microscópio óptico.


Procedimentos:

Coloração simples e Coloração de Gram

1. Coloração simples

  • Espalhamos o material no centro da lâmina (esfregaço). Deixamos secar a temperatura ambiente.
  • Após a secagem, passamos a lâmina sobre a chama do bico de Bunsen (fixação).
  • Cobrimos o esfregaço com uma gota de azul de metileno durante 1 minuto.
  • Lavamos com água e secamos com papel absorvente. Observamos ao microscópio. Objetiva 100X com óleo de imersão.

2. Coloração de Gram

  • Preparamos um esfregaço de cada um dos materiais microbiológicos;
  • Deixamos secar a temperatura ambiente. Fixamos a lâmina sobre a chama;
  • Cobrimos o esfregaço com solução corante de cristal violeta, durante 1 minuto;
  • Retiramos o cristal violeta através de rápida lavagem com água;
  • Cobrimos o esfregaço com solução de lugol (iodo-iodeto) durante 30 segundos;
  • Lavamos rapidamente com etanol (10 a 15 s) e, em seguida, com água;
  • Cobrimos o esfregaço com solução de corante de fucsina durante 1 minuto;
  • Lavamos com água e secamos suavemente com papel absorvente.
  • Observamos ao microscópio. Objetiva 100X com óleo de imersão.


Resultado e Discussão

Coloração simples

A partir do experimento realizado no laboratório, observou-se que bactérias estavam coradas de azul bem intenso, já que o azul metileno penetrou para o citoplasma de todas as bactérias. Quando a lâmina foi lavada o corante não saiu por que as membranas celulares